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在基因表達(dá)調(diào)控的研究中，miRNA與lncRNA是十分重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。它們介導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，甚至是翻譯調(diào)控幾個(gè)重要的基因表達(dá)模塊。與此同時(shí)，miRNA與lncRNA兩者又有著十分微妙的相互作用關(guān)系。
圖1 miRNA與lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的相互關(guān)系
圖2 miRNA與lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用機(jī)制
圖3 miRNA調(diào)控lncRNA
LncRNA可以通過直接與靶基因結(jié)合來激活或抑制靶基因的表達(dá)，還能通過參與組蛋白修飾或募集轉(zhuǎn)錄因子而參與基因的表達(dá)調(diào)控，也可以作為一種競爭性內(nèi)源性 RNA 與miRNA相互作用，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控。LncRNA可作為ceRNA與miRNA之間互相調(diào)控。
由于多數(shù)LncRNA的結(jié)構(gòu)與mRNA 具有一定的相似性，提示 miRNA可能通過類似于mRNA 的作用機(jī)制負(fù)性調(diào)控LncRNA的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮一系列生物學(xué)作用。同時(shí)，miRNA也能促進(jìn)特異LncRNA的表達(dá)。
MicroRNA（miRNA）是一類長度為 20-25nt，從發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體加工而來的具有基因調(diào)控功能的小分子非編碼 RNA，能與受其調(diào)控的靶 mRNA 的 3’非編碼區(qū)(3’UTR)互補(bǔ)結(jié)合，通過降解靶基因 mRNA 或抑制 mRNA 的翻譯在真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，并廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控等過程。研究證明，miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。miRNA 與細(xì)胞的癌變及多種腫瘤的發(fā)生有著極為密切的關(guān)系，其可作為一種新的癌基因或抑癌基因參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。miRNA基因通常是在核內(nèi)由RNA聚合酶II(polI)轉(zhuǎn)錄的，最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA。成熟的 miRNA 是由較長的有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)Dicer 酶加工而來的。miRNA 基因存在于基因組的基因間隔區(qū)、外顯子區(qū)或者基因的內(nèi)含子當(dāng)中。
圖4 miRNA前體結(jié)構(gòu)
1 miRNA特點(diǎn)
1） 廣泛存在于真核生物中, 是一組不編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)源性單鏈短序列小分子RNA , 它本身不具有開放閱讀框架(ORF) 。 通常的長度為18～25 nt , 但在3′端可以有1～2 個(gè)堿基的長度變化。
2) 成熟的miRNA 5′端有一磷酸基團(tuán), 3′端為羥基, 兩者可以和上游或下游的序列不完全配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。 這一特點(diǎn)使它與大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA 的降解片段區(qū)別開來。
3）多數(shù)miRNA具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。miRNA 不僅在結(jié)構(gòu)上保守，而且在物種間具有高度的進(jìn)化保守性。細(xì)胞特異性和組織特異性是 miRNA 表達(dá)的主要特點(diǎn)。
4）miRNA 基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中(圖1)，而且絕大部分位于基因間隔區(qū)(intergenicregion，IGR)。
2 miRNA的生物發(fā)生
目前，動(dòng)物 miRNA 的生物合成、加工、運(yùn)輸和作用原理已經(jīng)初步闡明。
圖5 miRNA產(chǎn)生過程模式
首先，在 RNA 聚合酶作用下細(xì)胞核中編碼 miRNA 的基因轉(zhuǎn)錄生成長度約為幾千個(gè)堿基的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本 pri-miRNA，Pri-miRNA 在 5’端具有甲基化的鳥嘌呤，而 3’端具有多聚腺嘌呤堿基，同時(shí)具有一個(gè)或幾個(gè)局部的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，以多順反子形式存在。并且，α-amanitin 可以抑制這一轉(zhuǎn)錄過程。有一部分 miRNA 的轉(zhuǎn)錄是由 RNA 聚合酶 II 所完成的。Pri-miRNA 的進(jìn)一步加工主要在 microprocessor 的蛋白復(fù)合體完成(圖2)。這個(gè)大小約為 400-500 kDa 大小的復(fù)合體主要由 Drosha 和 Pasha 兩個(gè)蛋白組成。其中 Drosha 為一種 RNase III 蛋白，而 Pasha 則是一個(gè)雙鏈RNA 結(jié)合蛋白(double-stranded RNA binding protein)，參與 Drosha 對(duì)底物的識(shí)別。Pri-miRNA 在 Drosha 的作用下進(jìn)一步被加工成含有 60～70nt 具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 miRNA 前體(pre-miRNA)。 pre-miRNA 在 RanGTP/Exportin-5 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA 被 Dicer 識(shí)別，并通過對(duì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的剪切和修飾，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成 miRNA:miRNA*二聚體。 miRNA:miRNA*二聚體在解旋酶作用下，最終生成成熟的、具有功能單鏈 miRNA，并隨之和 miRNP(miRNA ribonucleoproteins)復(fù)合體結(jié)合，而miRNA*則被迅速降解。
3 miRNA作用機(jī)制
圖6 miRNA介導(dǎo)基因沉默機(jī)制
圖7 miRNA接到信使RNA降解
miRNA 在發(fā)揮作用之前，需要同細(xì)胞內(nèi) Germin3、Germin4 和 Argonaute蛋白家族成員 eIF2C2 因子等協(xié)同因子結(jié)合形成蛋白質(zhì)-RNA 復(fù)合物(miRNA-containing ribonucleoprotin，miRNP)，在 miRNP 的作用下指導(dǎo)其識(shí)別同源 mRNA，研究認(rèn)為 miRNP 即為 RISC，并引起靶 mRNA 的降解或翻譯的抑制。 miRNA 對(duì)靶基因的調(diào)控表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上，通過對(duì)靶基因 mRNA 的切割或?qū)ζ浞g抑制兩種機(jī)制來下調(diào)靶基因的表達(dá)。這兩種機(jī)制的選擇主要取決于它與靶基因 mRNA 序列互補(bǔ)的程度，如果 miRNA 與靶基因 mRNA完全互補(bǔ)，miRNA 將通過切割方式來調(diào)控靶基因；如果 miRNA 與靶基因mRNA 不完全互補(bǔ)， miRNA 將通過翻譯抑制的方式來調(diào)控靶基因；并且對(duì)靶基因翻譯的抑制可能需要多種 miRNA 分子的協(xié)同作用 。在動(dòng)物體內(nèi)，大部分 miRNA 不能與靶基因的 mRNA 完全互補(bǔ)，故被認(rèn)為主要通過翻譯抑制的方式來調(diào)控靶基因。
（1）在大多數(shù)情況下包括人類，大多數(shù)動(dòng)物復(fù)合物中的成熟 miRNA與靶基因 mRNA3’端非翻譯區(qū)(untranslatedregion，UTR)不完全互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，抑制該基因的翻譯過程，從而抑制基因的表達(dá)。
miRNA 以 4種不同的方式抑制蛋白質(zhì)表達(dá)：①與翻譯偶聯(lián)的蛋白質(zhì)降解；②翻譯延長的抑制；③翻譯提前終止(核糖體脫落)；④翻譯起始的抑制。另外，盡管有不完全的 mRNA—miRNA 堿基配對(duì)，動(dòng)物 miRNA 能夠誘導(dǎo)mRNA 靶基因大量降解。微 RNA 還可以在稱為 mRNA 加工體或 P 體(不存在翻譯機(jī)制)的獨(dú)立細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn)，通過螯合 mRNA 使其沉默。miRNA 是否進(jìn)行 mRNA 降解主要取決于 miRNA 結(jié)合位點(diǎn)和 RNA 環(huán)境的特定性質(zhì)，最可能的決定因素是 miRNA 與特定標(biāo)靶結(jié)合蛋白的特殊相互作用。miRNA 可以與 Ago2 結(jié)合，將與它們結(jié)合的靶基因 mRNA 轉(zhuǎn)移到并富集于細(xì)胞質(zhì)的某一部位，在那里 mRNA 被破壞，這個(gè)部位被稱為 P 小體，P體的其他組分，如 GW182、CAF-CCR4-NOT 脫腺苷酶復(fù)合物、脫帽酶 DCP2、脫帽激活因子（如 DCP-1、EDC3、Ge-1）和 RNA 解旋酶 RCK/p54 等都參與 miRNA 功能。
（2）當(dāng) miRNA 與 mRNA 完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，則引起目的基因 mRNA 在互補(bǔ)區(qū)的特異性斷裂，從而導(dǎo)致基因沉默，這種 miRNA 對(duì)靶基因 mRNA 的切割對(duì)靶基因 mRNA 的切割是大多數(shù)植物、病毒和部分動(dòng)物的 miRNA 調(diào)控靶基因的主要方式。miRNA 可以指導(dǎo)對(duì)靶基因 mRNA 的多次切割而本身保持完整，這種作用方式與 siRNA 類似，miRNA 對(duì)基因的調(diào)控也是通過構(gòu)成 RISC 來進(jìn)行的，RISC 是其調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)。RISC 組成的核心成分是 miRNA或 siRNA 以及各種蛋白，其中 Ago 蛋白是該復(fù)合體中的核心蛋白，具有非常重要的作用。
4 miRNA研究方法
miRNA 基因及其調(diào)控的靶基因的表達(dá)，構(gòu)成了一個(gè)非常嚴(yán)密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的精確運(yùn)行確保了生物體各種生理過程的正常運(yùn)行。因此，miRNA 自身的表達(dá)與否，表達(dá)多少，及其對(duì)下游靶基因的調(diào)控均對(duì) miRNA 行使特定功能具有重要意義。目前，對(duì) miRNA 表達(dá)的鑒定仍然主要依靠以雜交和 PCR 為主的相關(guān)方法。對(duì)其功能線索的獲得，則主要依賴于在特定細(xì)胞或動(dòng)物模型內(nèi)外源性抑制或表達(dá)相應(yīng)的 miRNA 基因，再通過報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證后檢測特定細(xì)胞或動(dòng)物模型發(fā)育過程中的生化或分子變化來實(shí)現(xiàn)。并同時(shí)利用報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì) miRNA 的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。
（1）miRNA 分子的檢測
由于miRNA 是一類很小的分子，部分miRNA 表達(dá)水平可能很低。因而需要極為靈敏的定性、定量分析方法。目前多采用Northern Blots的方法來檢測 miRNA 的存在，此外還有 RT-PCR、Realtime-PCR 和 miRNA 芯片等方法。
① Northern Blots
Northern blots 是研究基因在 miRNA 水平表達(dá)的可靠手段，在基因表達(dá)的研究中被廣泛應(yīng)用。 Northern 雜交具有靈敏性高的特點(diǎn)，不僅可用于檢測miRNA在組織細(xì)胞中的表達(dá)水平，還可結(jié)合使用RNA marker檢測miRNA的分子大小，這對(duì)于排除其它小分子 RNA 的污染有重要意義。Northern 雜交也可作為 miRNA 定量的方法。通常，Northern 雜交后的放射自顯影/化學(xué)發(fā)光方法常在 20～25 bp 區(qū)域顯示成熟 miRNA 單一雜交帶，有時(shí)則出現(xiàn) 2 條或 3 條條帶，這是由 miRNA 前體加工過程中 RNA 雙體(miRNA：miRNA* ) 剪切位點(diǎn)的細(xì)微差別所導(dǎo)致。此外，在 70～80 bp 位置有時(shí)也會(huì)出現(xiàn) miRNA 前體雜交信號(hào), 但并不穩(wěn)定, 或許與總 RNA 質(zhì)量有關(guān)。
Northern Blots 雜交的缺點(diǎn)是對(duì) RNase 污染異常敏感，任一步操作不當(dāng)都會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，Northern Blots 對(duì)樣品的需求量較高，需要微克級(jí)樣品才能避免假陰性，有時(shí)樣品量達(dá)到 40 μg 才會(huì)出現(xiàn)明顯雜交信號(hào)。
② miRNA 芯片技術(shù)
miRNA 芯片技術(shù)可以高通量的檢測基因表達(dá)譜，它可以在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)鑒定所有已知 miRNA 的表達(dá)譜。最初的 miRNA 基因芯片，是將反義 DNA探針點(diǎn)在尼龍膜上，然后以 5’端放射性標(biāo)記的 miRNA 樣品雜交，再經(jīng)放射自顯影獲得信號(hào)。通過芯片上的 miRNA 基因及對(duì)照序列，可精確的分析出樣品中所有已知的 miRNA 的表達(dá)水平。目前，已有很多研究應(yīng)用該技術(shù)建立了不同物種不同組織中 miRNA 的表達(dá)譜，亦有研究比較了正常組織和和疾病組織中 miRNA 表達(dá)譜的差異。但是 miRNA 芯片只能分析已知的miRNA 表達(dá)水平，不能分析未知的 miRNA。在芯片的基礎(chǔ)上，Nelson 等提出一種稱為 RAKE (RNA-primed, array-based Klenow)的方法，在特定的細(xì)胞中同時(shí)檢測所有 miRNA 的表達(dá)譜，并且能夠檢測出福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的 miRNA 表達(dá)譜。盡管基因芯片技術(shù)敏感度有了很大提高，且可用于多個(gè) miRNA 同時(shí)檢測，但仍有不足：芯片檢測的前提是分離得到高質(zhì)量的低分子量 RNA 組分；基因芯片的制作和檢測需要昂貴的儀器設(shè)備；結(jié)果是半定量的，重復(fù)性較差；不能同時(shí)優(yōu)化所有待測 miRNA 的雜交環(huán)境，因而不能區(qū)分高度類似的 miRNA 等。
③ miRNA qRT-PCR
傳統(tǒng)的 qRT-PCR 不適合于檢測 miRNA 這種僅有 17~25nt 大小的小RNA，但通過特殊設(shè)計(jì)的 RT 引物，配合 qPCR 引物及探針就可以精確檢測微量樣品中 miRNA 的表達(dá)水平，也可以用于終點(diǎn) RT-PCR 定性檢測。Stem-loop 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 是一種高特異度、敏感度的檢測 miRNA 表達(dá)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)(圖 6)，包括用包括設(shè)計(jì)具有莖環(huán)( stem-loop )結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和用 miRNA 熒光標(biāo)記的特異分子探針進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 2 個(gè)關(guān)鍵步驟。該技術(shù)相對(duì)其它 microRNA 檢測技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：高度特異性：可以只對(duì)成熟 microRNA 進(jìn)行定量，有效區(qū)分成熟 microRNA 分子和前體分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度：從幾個(gè)拷貝到幾萬個(gè)拷貝，定量線性范圍跨越 7 個(gè)數(shù)量級(jí)；樣品消耗少：僅需1～10 ng 的總 RNA；適用范圍廣：總 RNA 、細(xì)胞裂解物以及純化的 RNA都可用于 miRNA 的定量檢測。也可用于其他小分子 RNA 的檢測。
（2）研究 miRNA 的生物信息學(xué)方法
在 miRNA 研究領(lǐng)域中，生物信息學(xué)方法的廣泛應(yīng)用得益于對(duì) miRNA 功能作用機(jī)制的深入闡明。目前，生物信息學(xué)在 miRNA 研究中的應(yīng)用，主要集中在 miRNA 基因和 miRNA 靶基因的預(yù)測兩個(gè)方面。
① miRNA 基因預(yù)測
隨著人們對(duì) miRNA 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及保守性的逐漸了解，計(jì)算機(jī)預(yù)測正成為尋找新小 RNA 基因的主要方法。
目前，大部分的軟件預(yù)測都主要依據(jù) miRNA 在進(jìn)化過程中的保守性及其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體來進(jìn)行。在眾多 miRNA 預(yù)測軟件預(yù)測的大量候選 miRNA 基因中，只有少數(shù)已被實(shí)驗(yàn)確證,但沒有被檢測到表達(dá)的 miRNA 基因，并非一定就是假陽性結(jié)果，因?yàn)檫@些候選基因的表達(dá)模式可能尚未被人們所了解。
② miRNA 靶基因的預(yù)測
自從 2003 年第 1 個(gè) miRNA 靶基因預(yù)測軟件問世以來，至今已有數(shù)十種專業(yè)軟件被用來預(yù)測 miRNA 靶基因。這些軟件的計(jì)算法則通常是：①種子序列(miRNA 5＇端 2～8nt)和靶基因 3＇UTR 區(qū)之間的互補(bǔ)程度；②miRNA_靶基因二聚體的自由能大小，即熱力學(xué)穩(wěn)定性；③靶基因非翻譯區(qū)序列跨物種的保守性等。目前預(yù)測 miRNA 靶基因的常用數(shù)據(jù)庫有： miRBase、TargetSca、PicTar、miRanda 等。
③ miRNA 靶基因的鑒定
利用熒光定量 PCR 及 Western blot 方法分別檢測轉(zhuǎn)染或封閉 miRNA 后細(xì)胞中感興趣的 mRNA 水平及蛋白水平的變化, 從而確定 miRNA 與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這種方法能夠直接鑒定出 miRNA 的靶基因, 準(zhǔn)確度高，但不能鑒定 miRNA 的靶位點(diǎn)。
目前最常用的是構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體。其基本原理是：在熒光素酶報(bào)告基因載體的報(bào)告基因編碼區(qū)的下游插入含有靶基因的 3’UTR 區(qū)，然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng) miRNA 的表達(dá)水平，通過檢測熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染 3’UTR 中是否含有 miRNA 的靶位點(diǎn)。
長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一類本身不編碼蛋白,長度在200-100000 nt之間的RNA分子的長鏈非編碼RNA分子。它可在多層面上（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達(dá)。lncRNA最初被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是一種“噪音”，不具有生物學(xué)功能。研究表面，lncRNA參與了X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程，其調(diào)控作用正在被越來越多的人研究。
1 LncRNA特點(diǎn)
（1）lncRNAs通常較長，具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)過剪接，具有polyA尾巴與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，分化過程中有動(dòng)態(tài)的表達(dá)與不同的剪接方式。
（2）有組織特異性與時(shí)空特異性，不同組織之間的lncRNA表達(dá)量不同，同一組織或器官在不同生長階段，其中的lncRNA表達(dá)量也會(huì)變化。
（3）調(diào)控多樣性，lncRNA可從染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后加工等多種層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。lncRNAs啟動(dòng)子同樣可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，如Oct3/4，Nanog, CREB, Sp1, c-myc, Sox2與p53，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結(jié)構(gòu)特征。
（4）序列上保守性較低，只有約12%的lncRNA可在人類之外的其它生物中找到。
（5）在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達(dá)方式。
哺乳動(dòng)物蛋白編碼基因占總RNA的1%，長鏈非編碼RNA占總RNA的比例可達(dá)4%-9%，這些長鏈非編碼RNA是基因功能研究的又一座寶庫。目前發(fā)現(xiàn)的許多l(xiāng)ncRNA都具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，一定的剪切形式以及亞細(xì)胞定位。它們?cè)诨蚪M上相對(duì)于蛋白編碼基因的位置，可以分為5種：正義鏈（sense）、反義鏈（antisense）、雙向（bidirectional）、內(nèi)含子間（intronic）、基因間（intergenic），其所在的位置與其功能有一定的相關(guān)性。
2 LncRNA作用機(jī)制
長鏈非編碼RNA的作用機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全清楚。根據(jù)目前的研究，lncRNA的作用機(jī)制如要有以下幾種。
（1）編碼蛋白的基因上游啟動(dòng)子區(qū)（橙色）轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因（藍(lán)色）的表達(dá)
（2）抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因（藍(lán)色）的表達(dá)；
（3）與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈（紫色），干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；
（4）與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈（紫色），在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；
（5）與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本（綠色）可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；
（6）作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；
（7）結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的細(xì)胞定位；
（8）作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。
圖8 LncRNA作用機(jī)制
3 LncRNA研究方法
圖9 LncRNA研究策略
（1）lncRNA篩選：通過lncRNA芯片或RNA測序等方法對(duì)多對(duì)疾病模型和對(duì)照樣本組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析；通過生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達(dá)差異的lncRNA，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測lncRNA的靶基因；通過PCR或Northern Blot技術(shù)對(duì)候選lncRNA驗(yàn)證，確定其表達(dá)差異。
（2）lncRNA全長克?。嚎梢酝ㄟ^5'RACE獲取lncRNA 5'全長，3'RACE獲取lncRNA 3'全長，最終拿到完整的lncRNA序列。
（3）表達(dá)分析。
細(xì)胞水平表達(dá)：在細(xì)胞水平進(jìn)行檢測表達(dá)差異。
組織分布：檢測不同組織、不同階段表達(dá)特性。
表達(dá)水平動(dòng)力學(xué)變化：比較不同處理?xiàng)l件下，如藥物處理、誘導(dǎo)處理下，表達(dá)水平差異。
（4）功能研究。
功能獲得性研究：構(gòu)建lncRNA過表達(dá)載體。
功能缺失性研究：可通過siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，干預(yù) lncRNA后檢測其對(duì)疾病相關(guān)基因表達(dá)影響和對(duì)細(xì)胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等的影響。
可通過RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法檢測與lncRNA結(jié)合的DNA、RNA、蛋白質(zhì)。
表達(dá)調(diào)控：將lncRNA表達(dá)與其他領(lǐng)域相結(jié)合，解釋lncRNA調(diào)控機(jī)理。
轉(zhuǎn)錄因子：研究lncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制；
染色質(zhì)重塑：lncRNA表觀調(diào)控；
ceRNA機(jī)制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調(diào)控機(jī)制。