走向基因組3D世界 ——染色體構(gòu)想捕獲技術(shù)3C(chromosome conformation capture)

日期：2018-11-30 標(biāo)簽：染色體構(gòu)象捕獲,3C,4C,5C,HiC

在過去10年中，染色體構(gòu)象捕獲（chromosome conformation capture 3C）技術(shù)及其該技術(shù)的拓展技術(shù)(4C,5C,Hi-C, ChIA-PET)，使人們能夠以超強(qiáng)的分辨率和高通量測序分析細(xì)胞核內(nèi)的三維立體結(jié)構(gòu)

一、3C技術(shù)：走向三維（3D）基因組學(xué)的基礎(chǔ)

1.交聯(lián)：用甲醛交聯(lián)染色質(zhì)，固定蛋白與DNA，使染色質(zhì)保持三維結(jié)構(gòu)。

2酶切：再用一種限制性內(nèi)切酶（HindIII、BglII、SacI、BamH或EcoRI）切割染色質(zhì)，蛋白周圍的互作基因切開。使互作DNA與其他非互作DNA分離。

3連接：重新連接交聯(lián)DNA片段的粘性末端。互作DNA的兩端具有相同的粘性末端，可以互相連接形成loop。

4 PCR：第3步形成的loop有兩種，一種是同一基因間的loop，一種是互作基因間的loop，用PCR的方式區(qū)分這兩種loop。

Fig.1染色體構(gòu)象捕獲（3C）過程

二、3C的延伸：4C,5C,Hi-C, ChIA-PET 

3C技術(shù)主要是研究點(diǎn)對點(diǎn)的基因互作，即特定的兩個(gè)基因間的互作，如基因A與基因B的互作。如果我們想研究一個(gè)基因與多個(gè)基因互作，或多個(gè)基因與多個(gè)基因互作呢？這就衍生出了4C,5C,Hi-C技術(shù)。如果我們想知道特定蛋白下的基因互作呢？這就衍生出了ChIP-loop和ChIA-PET。

Fig.2 3D基因組研究方法綜述

◆3C (one-vs-one)

主要研究點(diǎn)對點(diǎn)的基因互作

◆4C (one-vs-all)

主要研究一個(gè)特定基因與其所有互作的基因的互作。4C是在3C基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了雙酶切位點(diǎn)，然后通過成環(huán)的形式，保證了只需要設(shè)計(jì)1對引物，就可以檢測1個(gè)位點(diǎn)對多個(gè)位點(diǎn)的相互作用。 最后一個(gè)C為circle，環(huán)化，這也是4C中最關(guān)鍵的一步。

◆5C (many-vs-many)

主要多基因與多基因的互作。5C技術(shù)是在4C的技術(shù)上，加了個(gè)tag標(biāo)簽，導(dǎo)致可以檢測many-to-many的相互作用。

◆Hi-C (all-vs-all)

Hi-C使用了高通量測序的方法，理論上它能夠捕捉到所有的基因間的互作。HiC基本步驟是，甲醛交聯(lián)，限制酶切，末端補(bǔ)平加biotin，平末端連接，超聲破碎，biotin富集，建庫測序。整個(gè)過程是沒有特異性引物存在的。而且依靠高通量的測序技術(shù)，Hi-C可以展現(xiàn)出，整個(gè)染色體all-to-all的互作關(guān)系。

◆ChIP-loop （one-vsone）

ChIP-loop是使用特異性抗體捕獲蛋白，檢測與這個(gè)蛋白特異結(jié)合的兩條DNA，連接兩條互作DNA，形成loop，再進(jìn)行PCR檢測。（ChIP+3C）

◆ChIA-PET (all-vs-all)

ChIA-PET 是用抗體將目標(biāo)蛋白捕獲下來，然后加入adapter后，再進(jìn)一步用Hi-C方法得到通過目標(biāo)蛋白進(jìn)行相互作用的所有基因（ChIP+adapter+Hi-C）

三、應(yīng)用案例

應(yīng)用一：3C

3C技術(shù)已經(jīng)在β-珠蛋白中得到證實(shí)：

 Fig.3

3C數(shù)據(jù)和ACH active chromatin hub活性染色質(zhì)中樞。（A）3C數(shù)據(jù)展現(xiàn)小鼠β-珠蛋白基因附近的增強(qiáng)子loop。此圖展現(xiàn)的是β-major基因與其他染色質(zhì)的互作位點(diǎn)，β-major基因?yàn)?C的錨定點(diǎn)，灰色區(qū)域?yàn)闄z測的互作區(qū)域，紅色箭頭所指為強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)，即形成loop的區(qū)域，紅色折現(xiàn)表示胎鼠肝臟組織中的基因間的互作強(qiáng)度，藍(lán)色折現(xiàn)表示胎鼠大腦中的基因間的互作強(qiáng)度，胎鼠肝臟中β-珠蛋白基因?yàn)榧せ顮顟B(tài)，形成loop，胎鼠大腦中β-珠蛋白基因?yàn)槌聊瑺顟B(tài)，未形成loop，（b）基于b-globin locus位點(diǎn)的各種3C實(shí)驗(yàn)，提出了ACH模型。示意圖顯示了β-珠蛋白基因活化時(shí)的染色質(zhì)構(gòu)想。

應(yīng)用二：4C 

Fig.4 

(A)在4C-seq中，在成環(huán)處設(shè)計(jì)測序特異引物PCR，可以使得產(chǎn)物可以在不用建庫的情況下測序。讀數(shù)包含引物和連接節(jié)點(diǎn)。在去除引物序列后，其余的讀數(shù)與基因組比對。（B）染色體圖顯示小鼠RAD23位點(diǎn)在神經(jīng)前體細(xì)胞中的原始4C-seq統(tǒng)計(jì)。4C剖面顯示了側(cè)向的特征峰。(C)利用窗口化方法，例如運(yùn)行平均值或中值，對數(shù)據(jù)應(yīng)用低通濾波器，從而可以基本上無噪聲地觀察染色體相互作用。(D)最后，可以采用高級(jí)分析，例如用于可視化的域圖或基于錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)的方法來識(shí)別統(tǒng)計(jì)上顯著的相互作用。域圖是在給定區(qū)域中富集4C捕獲的多尺度表示。高亮區(qū)域顯示顯著富集4C捕獲的基因組區(qū)域。基于FDR的方法可用于識(shí)別顯著富集的區(qū)域。紅色的弧線顯示與哪些基因形成了連接節(jié)點(diǎn)。

應(yīng)用三：5C與Hi-C

Fig.5 

5C和HiC提供相互作用頻率的矩陣。(A)對非活性和活性a-globin locus (頂部)周圍500kb的5C結(jié)果進(jìn)行建模，以表明活性位點(diǎn)采用更開放的構(gòu)象，而在非活性狀態(tài)下，該位點(diǎn)顯示封閉構(gòu)象(底部)。（b）基于HiC數(shù)據(jù)，可以繪制染色體寬的相互作用頻率矩陣。示出具有1-MB分辨率（具有100 kb的步長）的人類染色體14的接觸圖。中間面板顯示格子狀圖案，這是HIC分析方法的最終結(jié)果。右邊的面板顯示了一個(gè)分形球體，一個(gè)基于HiC數(shù)據(jù)和理論分析的人類染色體組織模型。

應(yīng)用四：ChIA-PET

ChIA-PET最近被應(yīng)用于揭示CTCF介導(dǎo)的相互作用體在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）中的作用。由CTCF形成的識(shí)別環(huán)能夠?qū)⒃鰪?qiáng)子與啟動(dòng)子分開，以及活性染色質(zhì)與非活性染色質(zhì)分開，因此對于其絕緣子功能或促進(jìn)遠(yuǎn)端增強(qiáng)子與基因之間的通信非常重要（fig 6）。

Fig.6 

CHI-PET為CTCF蛋白的染色體互作提供了深入的了解。（a）三個(gè)ChIA-PET文庫，用于分析絕緣體蛋白CTCF與染色體結(jié)合的結(jié)果。配對末端標(biāo)記顯示兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間可能的相互作用。在基因組位點(diǎn)之間形成弧形突出環(huán)。（b）在A中顯示的軌跡折疊的可能模型的示意性表示。

四、結(jié)語

　　我們生命體中的染色體不是線性的、一維的，而我們現(xiàn)在大部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，都是基于一維線性模型上設(shè)計(jì)的，這樣很有可能出現(xiàn)一些結(jié)果偏差，因此現(xiàn)在很多數(shù)據(jù)庫，也開始考慮加入基因遠(yuǎn)程調(diào)控的影響。

　　為了真正了解基因組調(diào)控機(jī)制，需要基于3C技術(shù)，將我們基因組中的線性DNA信息轉(zhuǎn)換為有功能性3D-基因組網(wǎng)絡(luò)。3D基因組的研究在個(gè)體發(fā)育、在表觀遺傳、在腫瘤行成轉(zhuǎn)移、在衰老，這些領(lǐng)域中有著重要的研究意義。也許你的基因看上去沒變化，但是你就不一樣。

參考文獻(xiàn)：Tolhuis B, Palstra RJ, Splinter E, Grosveld F and de Laat W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. Mol. Cell. 2002,?10?(6): 1453–1465.?PMID?12504019.?doi:10.1016/S1097-2765(02)00781-5.